Psilosybiinisienten kasvatusopas/Kasvualustan valmistaminen ja käsitteleminen epätoivottujen kasvustojen torjumiseksi

Työskenteleminen ja puhtaus

Ilmassa leijailee lukematon määrä erilaisia pieneliöitä. Kuutiosenttimetri huoneilmaa sisältää keskimäärin 100 000 hiukkasta. Näkymätön sade itiöitä, pölyä ja saasteita laskeutuu jatkuvasti huoneen pinnoille. Ainoa tapa estää näitä eliöitä kaappaamasta sienen kasvualustaan on estää niitä pääsemästä sinne. Epähalutuista kasvustoista vapaan kasvualustan perusta on sen käsitteleminen korkeassa lämpötilassa esimerkiksi painekeittimen avulla. Puhdas kasvusalusta on sienen keskeisimpiä elinehtoja.

Työskentelytila ja työvälineet

Aina ennen kasvualustojen kanssa työskentelyä on syytä desinfioida työskentelytila ja -välineet. Työskentelytila on hyvä pitää yleisesti puhtaana ja pinnat voi pyyhkiä alkoholilla. Työskentelyn aikana on vältettävä liikkumista mahdollisimman paljon, sillä se laittaa liikkeelle kaikki ilmassa leijuvat hiukkaset. Sumuttamalla hienojakoista vettä tilaan saadaan ilmassa leijuvat hiukkaset laskeutumaan maahan. Työvälineet steriloidaan painekeittimessä tai pyyhitään alkoholilla. Hanskalaatikko (kts. rakennusohjeet) on erittäin hyvä apuväline estämään ilmavirtaukset, kun tehdään riskialttiimpia toimenpiteitä. Myös omaan hygieniaan on kiinnitettävä huomiota. Mahdollisimman puhdas keho, vaatteet ja mieli ovat avainasioita onnistumiseen. Pese aina kädet saippualla ennen työskentelyn aloittamista. Käytä kertakäyttökäsineitä tilanteen niin vaatiessa ja pyyhi ne alkoholilla aloittaessasi työskentelyn.

Kasvatusalustat

PF-tek: Vermikuliitti-riisijauhokakut

PF-tek (perustuu suosittuun "Psilocybe Fanaticus" tekniikkaan) on yleensä ensimmäinen kasvatustekniikka, jonka avulla tutustutaan sienten kasvatuksen perusteisiin. Sienet kasvatetaan vermikuliitin ja riisijauhon seoksessa, joka tuottaa painoonsa ja kokoonsa nähden suhteellisen pieniä satoja. Sienikasvustoa lisätään ruiskulla, joten voidaan käyttää vain itiöitä tai nesteviljelmää.

Ainesten keskinäinen suhde

2 osaa vermikuliittia 1 osa täysjyväriisijauhoa 1 osa vettä

Tarvikkeet

• 2,5 dl juomalaseja
• Läpinäkyvää pakkausteippiä
• Alumiinifoliota
• Puutarhalankaa
• Tummaa täysjyväriisijauhoa
• Vermikuliittia
• Vettä
• Sekoitusastia

Vaiheet

1. Laita vermikuliitti kulhoon. Lisää vettä niin kauan, että vermikuliitti ei sitä enää ime - kulhon pohjalle jää pieni määrä vettä. Lisää jauhot ja sekoita.
2. Täytä lasit varovasti, jotta substraatti ei pakkaudu. Älä tiivistä. Jätä yläreunaan noin 1 cm tyhjää tilaa. Rihmasto kasvaa nopeammin ilmavassa substraatissa.
3. Täytä loppuosa kuivalla vermikuliitilla. Tämä toimii ylimääräisenä suojana kontaminaatioita vastaan. Inokuloidessa neula painetaan tämän kerroksen läpi.
4. Peitä lasit foliolla ja teippaa foliot kiinni lasin ympäri.
5. Laita toinen kerros foliota ja kiinnitä se sitomalla puutarhalangalla. Mikäli käytät kannellista astiaa, kansi toimii toisena kerroksena.
6. Steriloi painekeittimellä 45 min (15 PSI). Tai steriloi kattilassa: laita lasit kattilaan, jossa on lasien puoliväliin asti vettä. Peitä kannella ja anna kiehua 90 min.

Jyvien käyttäminen

Sieni voi käyttää ravinteenaan monenlaista kokojyväviljaa mm. ruista, vehnää ja linnunsiemensekoitusta. Siemenet sisältävät erittäin paljon ravinteita. Myös maissinjyviä käytetään yleisesti. Vaikka maississa rihmasto kasvaa nopeammin, on siinä suuren jyväkokonsa vuoksi vähemmän pinta-alaa rihmastoiduttavaksi. Maissi on myös useita muita käyttökelpoisia jyviä vähäravinteisempaa. Jyviä käytetään ensisijaisena kasvualustana, joka voidaan lisätä suurempiin määriin toissijaista kasvualustaa.

Purkit ja valmistelu

Monet lasiset metallikannella varustetut purkit sopivat tarkoitukseen. Kannattaa käyttää 0,2-2 litran purkkeja, ottaen koon huomioon sterilointiajassa. Kansiin on tehtävä micropore-teipillä peitettävä reikä kaasunvaihdon mahdollistamiseksi.

Jyvien valmistelu

Kaikki viljat sisältävät suuria määriä piileviä bakteereita eli ns. bakteeri-itiöitä, joiden tappaminen ei onnistu ilman painekeitintä, eikä painekeittimelläkään ellei näitä bakteereita idätetä ensin. Idättämisen ja oikean kosteuspitoisuuden saavuttamiseksi jyviä keitetään ja liotetaan ennen lämpökäsittelyä. Jyviin voi halutessaan lisätä kalsiumsulfaattia eli kipsiä jotta ne eivät liimautuisi toisiinsa. Se toimii myös ylimääräisenä ravinteena rihmastolle.

Ainesosat per litran astia

• Jyviä (kuivana) 250 ml
• Jyviä (keitettynä) 750 ml
• Kalsiumsulfaattia 1 g
• 3% Vetyperoksidia 6 ml (Lisätään tarvittaessa steriloinnin jälkeen)
• Sterilointiaika (15 PSI) 90 min

Vaiheet

1. Valitse tarpeeksi suuri kattila. Jyvät turpoavat jopa kolminkertaiseksi imiessään kosteutta. Laita kattilaan kaksinkertainen määrä vettä.
2. Laita levy päälle. Anna kiehua täydellä teholla 15 minuuttia ja käännä levy pois päältä. Peitä kannella ja anna seistä vähintään 8 tuntia (mutta ei yli 16 tuntia). Tässä vaiheessa jyvien pitäisi olla niin pehmeitä että ne voi murskata sormien välissä.
3. Siivilöi jyvät. Jyvät ovat vielä märkiä ulkopuolelta. Kaikki tarpeellinen neste on imeytynyt jyviin joten anna kuivua yön yli rauhassa, jottei purkkeihin tulisi ylimääräistä vettä pohjalle.
4. Laita jyvät purkkeihin. Älä täytä purkkeja liian täyteen jotta pystyt ravistelemaan jyviä kolonisaation aikana. Lisää tarvittaessa kalsiumsulfaatti ja ravistele. Sulje purkit ja peitä kannet foliolla.
5. Steriloi purkit painekeittimellä.
6. Anna purkkien jäähtyä kunnolla ennen inokulointia.

Edellinen tapa ei kuitenkaan sovellu kaikille jyvätyypeille. Alla on toinen tapa nesteyttää jyvät. Näitä tapoja muuntelemalla (mm. liotus ja keittoaikaa muuttamalla) löydät itsellesi sopivan tavan nesteyttää kasvatusalustasi.

Nesteytettyjä vehnän jyviä.

1. Huuhtele jyvät kunnolla lävikössä.
2. Laita jyvät astiaan ja lisää vettä noin 2 kertaa jyvien tilavuuden verran.
3. Lisää liotusveteen ruokalusikallinen kipsiä.
4. Liota 24 tuntia.
5. Kuumenna vesi kiehuvaksi.
6. Kaada jyvät lävikköön kuumina.
7. Ravistele tasaisin väliajoin ja anna jäähtyä noin 20 minuuttia. Ylimääräinen kosteus poistuu höyryn mukana ja purkkeihin ei tule ylimääräistä vettä.
8. Laita jyvät purkkeihin. Peitä kannet foliolla ja steriloi painekeittimellä.

Jyviin voidaan lisätä sienikasvustoa itiöruiskulla, nesteviljelmällä tai agar-siirroksella. Purkkeihin voi tehdä injektioportit ruiskuja varten, jolloin niitä ei tarvitse avata (kts. nesteviljelmät).

Purkkien ravistelu

Tasaisen ja nopean kasvun saavuttamiseksi purkkeja kannattaa ravistella. Tällöin rihmasto hajoaa pieniksi palasiksi ympäri purkkia ja parin päivän sisällä se kasvaa entistä voimakkaammin. Purkkeja ravistellaan yhden kerran rihmastoitumisen aikana, noin 30% kohdalla. Ravistelussa rihmasto näyttää katoavan lähes kokonaan, mutta loppuosa kasvusta on huomattavasti tasaisempaa ja nopeampaa.

Rihmastoituneet jyvät

Kun kasvualusta on kokonaan rihmastoitunut, se tulisi käyttää mahdollisimman pian. Rihmastoitunut aines voidaan lisätä isompiin määriin jyviä. Jyvät voidaan kattaa ja siirtää kasvatustilaan. Paras vaihtoehto lienee kuitenkin toissijainen kasvualusta.

Epätoivotut kasvustot jyvissä

Bakteerikasvusto näkyy usein ravisteltaessa purkkia.

Homeita ja bakteereita esiintyy jyvissä samaan tapaan kuin PF-tek kakuissa. Tarkastele purkkeja usein, jotta huomaat saastumisen ajoissa ja voit poistaa purkin puhtaiden kasvustojen läheisyydestä. Kiinnitä huomiota eritoten muutama päivä ravistelun jälkeen, jolloin monesti piilossa olleet kasvustot paljastuvat.

Katekerros

Mikäli rihmastoituneet jyvät halutaan siirtää suoraan kasvatustilaan, on ne ensin katettava. Sen tarkoitus on tehdä ravinteeton katekerros rihmaston päälle, johon sienet kasvavat ja joka sitoo ja ylläpitää kosteutta. Jyvät kaadetaan minigrip-pussiin ja painellaan varovasti irtonaisiksi, minkä jälkeen ne kaadetaan alkoholilla puhdistettuun laakeaan astiaan. Jyvien päälle tehdään katekerros kostutetusta vermikuliitista — noin 1-2 cm kerros riittää.

Agar-viljelmä

Sienikantoja kasvatetaan, kloonataan, eristetään ja ylläpidetään agar-viljelmissä. Muoviseen tai lasiseen viljelysastiaan tehdään ravinnepitoinen puolikova seos jonka pinnalla sieni kasvaa kaksiulotteisesti. Se antaa mahdollisuuden helppoon tutkimiseen ja mahdollisten epätoivottujen kasvustojen havainnointiin. Kun agar-seos on lämmitetty, se jähmettyy jäähtyessään läpikuultavaksi hyytelöksi. Agar itsessään ei sisällä ravinteita, joten siihen lisätään erilaisia yhdistelmiä ravinteikkaita aineita kuten mallasuutetta tai hiivaravinnetta. Reseptiä kannattaa muunnella hieman, jotta sieni pysyisi elinvoimaisempana.

Agarin edut

Agar-viljelmän hyödyllisimpiä käyttömahdollisuuksia on kannan eristäminen. Kun kasvualustaan lisätään itiöitä, ne sisältävät useita geeniperimiä tuottaen siten useita erivahvuisia ja rakenteellisia sieniä. Kun työskennellään eristetyn kannan kanssa valikoidaan parhaat ominaisuudet omaavat sienet joita voidaan monistaa. Agar-viljelmiä lisätessä on mahdollista käyttää vetyperoksidia.

Viljelyastioiden käsittely ja säilytys

Voit käyttää joko muovisia tai lasisia viljelyastioita. Muoviset astiat on tarkoitettu lähinnä kertakäyttöisiksi mutta lasiset on helppo steriloida painekeittimessä ja käyttää uudelleen. Steriilit työskentelytavat ovat välttämättömiä. Kun siirroksia tehdään kansiosaa pidetään auki mahdollisimman lyhyt aika ja pidetään mielellään pohjan yläpuolella kontaminaatioiden välttämiseksi. Astiat teipataan kiinni micropore-teipillä ja säilytetään agar puoli ylöspäin. On kuitenkin hyvä antaa uuden siirroksen kasvaa kiinni agariin vähintään yksi päivä ennen astian kääntämistä. Käyttämättömät viljelmät voidaan säilyttää jääkaapissa. Viljelmät herätetään tekemällä uusi alaviljelmä toiselle astialle. Kasvualustaan lisääminen ei eroa muista siihen käytetyistä tekniikoista.

Reseptit

Nämä reseptit ovat vain muutamia esimerkkejä mahdollisuuksista. On olemassa useita eri muunnelmia ja kokeilemalla löydät parhaiten sopivan.

Malt Yeast Agar MYA (Riittää noin 20-30 100mm viljelyastialle)

• 22 g agar
• 12 g mallasuutetta
• 1 g hiivaravinnetta
• ¼ tl viljajauhoja (vaihdetaan joka kerralla jotta saadaan erilainen ravinnekoostumus, esim. riisi, vehnä, ruis jne.)
• 1 l vettä
• 8 ml 3% vetyperoksidia (lisätään tarvittaessa sterilisoinnin jälkeen, kts. astioiden valmistelu)

"Anything" agar (tällä voit laittaa rihmaston testiin)

• 22 g agar
• 20 g mitä tahansa hienonnettuna jauhoksi
• 1 l vettä

Vihannes agar

• 22g agar
• 200g perunoita
• 10g panimosokeria
• 1,5 l vettä (perunoiden keitinvesi)

Viipaloi perunat noin sentin paksuisiksi viipaleiksi kuorineen. Keitä niitä noin tunti 1,5 litrassa vettä. Siivilöi keitinvesi talteen ja lisää panimosokeri. Anna jäähtyä ja lisää agar-jauhe.

Agar-astioiden valmistelu

Astioiden valmistelu tehdään vähintään päivää aikaisemmin niiden käyttöä. On hyvä pitää useampi päivä välissä jotta mahdolliset home- tai bakteerikasvustot paljastuvat. Kannattaa tehdä kerralla suuri määrä astioita joita voi ottaa käyttöön tarvittaessa. Agar steriloidaan painekeittimellä ja kaadetaan astioihin ennen jähmettymistään.

1. Mittaa kaikki kuivat aineet astiaan. Lisää vesi. Käytä astiaa joka on vähintään 1,5-2 kertaa nesteen tilavuus jotta se ei kiehu yli. Peitä foliolla ja aseta painekeittimeen. Tarvittaessa laita myös viljelyastiat ja vetyperoksidin mittaamisessa tarvittavat välineet keittimeen.
2. Steriloi 30 min (15 PSI). Älä missään nimessä steriloi yli 45 min tai sokerit alkavat karamellisoitua, mikä ei ole hyvä sienelle.
3. Anna paineen tasaantua ja kattilan hieman jäähtyä. Siirrä kattila lämpimänä työskentelytilaan. Muista puhdas työskentely. Siirrä tarvikkeet hanskalaatikkoon. Agar on vielä lämmintä ja nestemäistä.
4. Jos käytät vetyperoksidia (muista ettet voi käyttää sitä jos aiot inokuloida itiöillä): Kun agar-astiaan voi koskea mutta se on vielä lämmin (noin 45-60°C) lisää vetyperoksidi.
5. Kaada neste viljelyastioihin siten että astian pohja juuri peittyy. Älä kaada liian nopeasti jotta vältät ilmakuplat.
6. Teippaa astiat kiinni micropore-teipillä. Jos haluat välttää kondensaation muodostumisen pinoa ne 5-6 astian pinoihin ja laita kupillinen kuumaa vettä jokaisen pinon päälle. Anna jäähtyä. Jos et käyttänyt vetyperoksidia laita astiat pussiin niiden jäähdyttyä.
7. Säilytä käyttämättömät astiat kuivassa ja vedottomassa paikassa.

Epätoivotut kasvustot

Kun työskennellään agar-viljemien kanssa homeet ja bakteerit huomataan nopeammin ja ne voidaan eristää terveiden joukosta. Saastuneet viljelmät kannattaa hävittää. Joskus on kuitenkin tarpeellista yrittää pelastaa saastunut viljelmä (mikäli aina tehdään useita siirtoja samasta viljelmästä ja noudatetaan puhdasta työskentelyä tämä on harvinaista). Tässä tapauksessa saastuneesta viljelmästä siirretään pala tervettä viljelmää uuteen astiaan. Tämä voi kuitenkin vaatia useamman siirron ennen kuin epähaluttu kasvusto on kokonaan poistunut.

Nesteviljelmä

Nesteviljelmä on vaihtoehtoinen tapa agar-viljelmälle. Se tarjoaa erinomaisen mahdollisuuden kloonaukseen sekä rihmaston testaamiseen ja säilytykseen. Purkissa oleva ravintopitoinen neste saatetaan rihmastoituvaksi joko itiöillä tai osalla sientä. Kasvutuloksia nähdään jo ensimmäisten vuorokausien aikana.

Nesteviljelmän edut ja haitat

Kun kasvualusta lisätään sientä nesteviljelmällä, on rihmastoituminen huomattavasti nopeampaa kuin itiöillä. Nesteviljelmä on myös erittäin itiötaloudellista, yhdestä itiöruiskusta voidaan lisätä sientä useisiin litroihin nesteviljelmiä. Nesteviljelmällä lisäämisen yhteydessä on mahdollista käyttää vetyperoksidia kasvualustassa. Rihmastoa voidaan säilyttää nesteviljelmässä pitkiäkin aikoja pitämällä se jääkaapissa. Rihmaston herättäminen pitkän säilytyksen jälkeen onnistuu nostamalla purkki huoneenlämpöön tunti ennen rihmaston siirtämistä ja sekoittamalla.

Suurin haitta on epätoivottujen kasvustojen havainnoimisen vaikeus. Ulkonäöstä on usein mahdoton sanoa onko rihmasto sientä vai esimerkiksi hometta - se selviää vasta lisäämällä viljelmä toiseen kasvualustaan. Nesteviljelmällä ei voida tehdä kannan eristämistä.

Reseptit

On tärkeää tehdä ravintoliuksesta oikean vahvuinen. Käytettäessä suurempia astioida pitoisuutta voidaan hieman lisätä mutta yleensä noin 2-3% kokonaispainosta on ravinteita. Ravinteena voi käyttä esim. hunajaa, siirappia, dekstroosia tai mallasuutetta. Nesteviljelmän voi todennäköisesti tehdä lähes mihin tahansa sokeripitoiseen nesteeseen.

3g hunajaa 100 ml vettä

Sopivat astiat ja neulaväylän valmistus

Nesteviljelyyn sopii lähes kaikki painekeittämistä kestävät läpinäkyvät kannelliset astiat. Metallikannelliset piltti- ja hillopurkit ovat erinomaisia. Kansissa on oltava kaksi reikää, toinen kaasunvaihtoon ja toinen työskentelyyn. Jälkimmäiseen on hyvä tehdä erillinen väylä neulalle, jotta saastumisriski pienenee.

Tarvikkeet

• Purkki
• Micropore-teippiä
• Kuumuutta kestävää silikonia
• Ruuvimeisseli

Vaiheet

1. Purkin kannen ollessa paikoillaan tee siihen kaksi reikää lyömällä napakasti ruuvimeisselillä.
2. Teippaa toinen reikä micropore-teipillä. Tämä reikä on kaasunvaihtoon.
3. Peitä toinen reikä muutaman millimetrin kerroksella silikonia. Tästä neula työnnetään läpi.

Nesteviljelmien valmistelu

Tee seokset kiehautettuun veteen. Täytä purkit hieman yli puoliväliin. Voit lisätä purkkiin pienen kuulan tai mutterin helpottamaan sekoittamista. Käsittele välineet ja purkit painekeittimessä enintään 30 min tai vesihauteessa 30 min. Pidempi aika aiheuttaa sokerien karamelisoitumisen.

Lisääminen itiöillä

Sienikasvuston lisääminen tapahtuu ruiskuttalla pieni määrä itiöitä injektioportin läpi jäähtyneeseen kasvualustaan. Muista kuumentaa neula ruiskutusten välissä.

Kasvun seuranta ja sekoittaminen

Ensimmäiset tulokset näkyvät alle 24h kuluttua kloonatuissa nesteviljelmissä ja 1-4 päivän kuluessa itiöillä lisätessä. Rihmasto kelluu puolivälissä astiaa valkoisena pilvenä. Nesteviljelmää on hyvä sekoittaa noin 4 päivän välein. Kun kasvu hidastuu ravinteet ovat loppumassa ja nesteviljelmä täytyy käyttää tai siirtää säilytykseen jääkaappiin.